1-1 مقدمه:
بهبود کیفیت غذای مصرفی همیشه یکی از مهمترین دغدغه‌های بشری بوده است. ازاین‌رو اصلاح گیاهان به عنوان اصلی‌ترین منبع تولید موادغذایی، جهت افزایش کیفیت و کمیت مواد تولیدی همواره مورد‌ توجه انسان بوده‌است. در چند دهه گذشته، با گسترش اطلاعات بیوشمیایی و کشف مسیرهای بیوسنتزی انواع متابولیت‌های تولیدی در گیاهان، همچنین شناخت دقیق‌تر ساختارهای ژنتیکی و دستیابی به روش‌های دستورزی ژنتیکی، امکان خلق گیاهانی با توانایی‌های خارق العاده در تولید انواع متابولیت‌های ضروری در گیاهان فراهم شده است. در سال‌های اخیر گیاهانی که قدمت زیادی در رژیم غذایی و دارویی انسان دارند، به علت تاثیرات مطلوب متابولیت‌های تولیدی و نیز جایگاهی که این متابولیت‌ها از نظر فرآیندهای انتقال ژن دراستانداردهای ایمنی زیستی دارند، در کانون توجه بسیاری از محققان رشته‌های مختلف اعم از کشاورزی،‌ صنایع‌غذایی، دارویی و پزشکی قرارگرفته‌است (محمدی‌ و ذوالعلی، اسفند1388). در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می‌باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می‌کنند که تحت عنوان متابولیت‌های ثانویه نام‌گذاری می‌شوند. در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک‌های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته‌اند از انواع گیاهان، ترکیب‌های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری‌های سخت و غیرقابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن‌ها می‌توان روش‌های ایجاد گونه‌های جهش یافته و پلی‌پلوئید را نام برد. کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی امکان تکثیر سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم و تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایط این‌ویترو1 را فراهم می‌کند. مهمترین روش‌های تکثیر درون‌شیشه‌ای گیاهان، ریزازدیادی2، اندام‌زایی ازطریق کالوس3 و جنین‌زایی سوماتیکی است. گزارش‌های متعددی در زمینه تکثیر گیاهان دارویی از طریق کالزایی وجود دارد. تولید کالوس قابلیت باززایی کالوس و ریشه‌زایی گیاهچه به عوامل متعددی بستگی دارد که مهمترین آن‌ها ژنوتیپ، ریزنمونه و شرایط فیزیولوژیک آنان، نوع محیط‌کشت و عناصرغذایی، عوامل فیزیکی و شرایط محیطی ازقبیل نور، دما، pH ، تنظیم‌کننده‌های‌رشد و ویتامین‌ها می‌باشد (باسو و چاند4، 1996؛ ساتیش و بهاواناندان5، 1988؛ شاسانی و همکاران61998).

1-2 اهمیت موضوع
کشت سلول، بافت و اندام‌های گیاهی امکان تکثیر انبوه و سریع گیاهان و تولید متابولیت‌های ثانویه را در شرایط In Vitro فراهم می‌سازد. با استفاده از کشت In Vitro گیاه، علاوه بر دسترسی به منبع اولیه دارو در شرایط کنترل‌شده و مستقل از محیط، افزایش تولید ترکیبات نسبت به گیاه و تولید ترکیبات جدید نیز امکان‌پذیر می‌گردد (بورگاد و همکاران7، 2002).
گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به عنوان یکی از مهمترین منابع دارویی کاربرد داشته‌اند. فناوری زیستی با استفاده از راهکارهایی نظیر کشت سلول، اندام‌ها و بافت‌ها، مهندسی ژنتیک و کاربرد نشانگرهای مولکولی قادر است کارایی و بهره‌وری گیاهان دارویی را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی امکان تکثیر سریع وانبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم را فراهم نموده است. گیاهان تکثیرشده از طریق کشت‌هایIn Vitro عاری از بیماری و از لحاظ ژنتیکی وکیفی یکنواخت می‌باشند (امیدی و فرزین، 1388).
کشت‌بافت گیاهی در زمینه گیاهان دارویی کاربردهای متعددی دارد که مهمترین آن‌ها عبارتند از: تکثیر انبوه و سریع گیاهان دارویی یکنواخت از لحاظ محتوای ژنتیکی وکیفی، حفظ گونه‌های گیاهی درحال انقراض از طریق نگهداری در شرایط انجماد و تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایطIn Vitro از طریق کشت سوسپانسیون سلولی و کشت اندام (مولاباگال وتسای8، 2004؛ تریپاتی و تریپاتی9، 2003).
روش‌های سنتی تکثیر گیاهان دارویی همانند سایر گیاهان شامل روش‌های جنسی (تکثیر با بذر) و غیرجنسی نظیر : قلمه، خوابانیدن، پاجوش و … می‌باشد. گیاهان تکثیر شده با بذر عمدتا از لحاظ ژنتیکی یکنواخت نیستند و گیاه حاصله دارای تمام خواص گیاه مادری نیست. به همین جهت تکثیر غیرجنسی به جنسی ترجیح داده می‌شود. روش‌های سنتی تکثیرغیرجنسی عمدتا با مشکلات متعددی از جمله محدودیت گیاه مادری و بازدهی پایین مواجه است. کشت‌بافت، نوعی تکثیر غیرجنسی است. مزیت تکثیر از طریق کشت‌بافت نسبت به سایر روش‌های مرسوم، تولید تعداد زیادی گیاه درمحیط in Vitro با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت، در زمان کوتاه‌تر و فضای نسبتا محدود می‌باشد (تریپاتی و تریپاتی، 2003).
فناوری زیستی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی امکان تولید سریع و انبوه ژنوتیپ‌های مطلوب با محتوای ژنتیکی یکسان و کیفیت یکنواخت، در زمان کوتاه‌تر و فضای محدود فراهم می‌سازد. امروزه تعداد زیادی از گیاهان دارویی از طریق ریزازدیادی قابل تکثیر می‌باشند (امیدی و فرزین، 1391).
تشکیل کالوس مرحله‌ای اساسی در کشت درون‌شیشه‌ای بسیاری از سلول‌ها و بافت‌های گیاهی و نیز برخی از روش‌های مهندسی ژنتیک است. برای مثال، کالوس‌های کشت‌شده در شرایط درون‌شیشه‌ای تکثیر شده و تعداد زیادی سلول ایجاد می‌کنند که از طریق اندام‌زایی یا جنین‌زایی رویشی قابلیت باززایی و تبدیل شدن به گیاه کامل را دارند. علاوه بر این، بافت کالوس عمدتا به عنوان بافت هدف برای دستکاری ژنتیکی استفاده می‌شود و تشکیل کالوس برای باززایی بافت‌های تراریخت لازم است. از کالوس‌های سست و نرم عموما برای ایجاد کشت سوسپانسون سلولی نیز استفاده می‌شود (اثنی‌عشری، 1388).
این گیاه در ایران با نام صبرزرد و یا شاخ بزی نیز معروف است. تنها گونه بومی موجود در ایران آلوئه ورا10 می‌باشد که در نواحی جنوب ایران و گونه آلوئه لیتورالیس11 در ارتفاعات بشاگرد می‌روید. از میان گونه‌های شناخته شده آلوئه، تنها 4 گونه آن برای انسان و دام خوراکی هستند که گونه آلوئه‌ورا در صدر آن قرار دارد (میرزایی ندوشن و همکاران، 1383 و آگاروال12، 2008).
بکارگیری روش‌های نوین زیستی در تولید، تکثیر و دست‌ورزی ژنتیکی این گیاه می‌تواند نقطه عطفی را در صنایع غذایی و دارویی ایجاد نماید. این گیاه به دلیل توانایی بالا در تحمل شرایط سخت خشکی و کم‌آبی، در سرتاسر دنیا گسترش یافته است. بهینه‌سازی فرآیند کشت‌بافت و باززایی آلوئه با تثبیت و واسطه‌گری کشت کالوس، راه‌گشای انجام تحقیقات بنیادی و کاربردی در زمینه‌های مختلفی نظیر القای جنین‌های سوماتیکی و تولید بذرمصنوعی، تثبیت کشت‌های سوسپانسیون سلولی و اصلاح گیاه از طریق تنوع سوماکلونال خواهد بود (محمدی و ذوالعلی، 1388).
به طور کلی در آلوئه‌ها، افزایش رویشی از راه جداسازی پاجوش‌ها و با تقسیم بوته متداول است ولی تکثیر این گیاه از راه جداسازی پاجوش‌ها کند بوده و وقت‌گیر است. بنابراین گیاهان محدودی از یک گیاه مادری به دست می آید. این موضوع عامل بازدارنده‌ای برای گسترش تولیدات صنعتی محسوب می‌گردد. با توجه به اهمیت گیاه صبرزرد و نبود مواد گیاهی کافی، کشت و کار این گیاه در سطح زیاد ایجاد محدودیت می‌کند که با روش ریزافزایی می‌توان بر این مشکل چیره شد (کواست13، 1979؛ ناتالی و همکاران14، 1990).
با توجه به این‌که پلی‌فنل‌ها، موادی هستند که در اولین مراحل بیوسنتزی تولید آنتی‌اکسیدان‌های مهمی نظیر فلاونوئید‌ها و آنتوسیانین‌ها را می‌کنند، لذا افزایش تولید این ترکیبات به کمک استفاده از غلظت‌های بهینه هورمون‌های اکسین و سیتوکینین می‌تواند روشی برای افزایش فلاونوئید‌ها و آنتوسیانین‌ها باشد. این دو ماده از مهمترین م
واد آنتی‌اکسیدانی می‌باشد که در جلوگیری از بروز سرطان نقش بسیار مهمی دارد. در گیاه آلوئه‌ورا دو متابولیت ثانویه آلودین و امودین از همین مسیر بیوسنتزی استفاده می‌کند. درنتیجه با افزایش تولید ترکیبات پلی‌فنلی می‌توانیم میزان این متابولیت‌های ثانویه ونیز آنتی‌اکسیدان‌ها را افزایش دهیم (احمد و همکاران15، 2007).
از آنجایی که تکثیر این گیاه از روش‌های مرتبط با بذر، به واسطه وجود نرعقیمی گسترده، راندمان پائینی دارد، تنها راه کشت سنتی آلوئه، تکثیر از طریق پاجوش است. با توجه به اینکه در طول یکسال حداکثر تا 4 پاجوش را می‌توان از یک گیاه 2 ساله جداسازی نمود، این موضوع رشد صنایع غذایی و دارویی مرتبط با این گیاه سودمند را به شدت کند خواهد کرد. لذا کاربرد تکنیک‌های مختلف کشت‌بافت در مورد این گیاه بسیار سودمند خواهد بود. با این حال اکثر تحقیقات انجام شده در راستای ریز‌ازدیادی این گیاه، با روش شاخسارزایی مستقیم می‌باشد. دلیل این امر، وجود ترکیبات گسترده فنولی است که از بافت‌های آلوئه در محیط کشت ترشح می‌شود. این موضوع باززایی گیاه را از کالوس، به شدت مشکل می‌کند. گزارشات اندک موجود از روش‌های غیرمستقیم کشت ‌بافت گیاه آلوئه، گواهی بر این مدعا است (آگاروال، 2008؛ احمد و همکاران، 2007 و روی و سارکار16، 1991 (.
با توجه به قدمت کاربرد آلوئه‌ورا و جایگاه روزافزون آن در فرهنگ غذایی و دارویی مردم و نظر به اینکه محصولات تولیدی برپایه آلوئه‌ورا در کانون توجه بسیاری از صنایع بزرگ تولیدی محصولات غذایی و دارویی قرار دارند، سرمایه‌گذاری در زمینه پروژه‌های دست‌ورزی ژنتیکی این گیاه کاملا توجیه اقتصادی خواهد داشت. از سوی دیگر بهینه‌سازی فرآیند کشت ‌بافت و باززایی آلوئه با تثبیت و واسطه‌گری کشت کالوس، راهگشای انجام تحقیقات بنیادی و کاربردی در زمینه‌های مختلفی نظیر القای جنین‌های سوماتیکی و تولید بذر مصنوعی، تثبیت کشت‌های سوسپانسیون سلولی و اصلاح گیاه از طریق تنوع سوماکلونال خواهد بود که خود نیز به عنوان زمینه‌ساز انجام پروژه‌های مرتبط با مهندسی‌ژنتیک و مهندسی مسیرهای بیوسنتز انواع متابولیت‌ها، مورد‌توجه قرار‌خواهدگرفت. دربسیاری از گزارشات ارائه شده در زمینه القای کالوس در ریزنمونه‌های جداشده از این گیاه، به مشکلات و دشواری‌هایی که در اثر وجود ترکیبات فنولی ایجاد می‌گردند، تاکید شده است. وجود این ترکیبات می‌تواند روند اندام‌زایی و جنین‌زایی غیرمستقیم در انجام پروژه‌های ریزازدیادی از طریق کشت‌بافت گیاه آلوئه را تحت تاثیر قرار دهد. همچنین فرآیند باززایی و اندام‌زایی در گیاه آلوئه‌ورا فرآیندی زمان‌بر است و تکمیل دوره کشت‌بافت آن هفته‌ها به طول می‌انجامد (روی و سارکار، 1991).

شکل 1-1 گیاه آلوئه ورا
1-3 فرضیات
1. با بکارگیری هورمون‌های گیاهان می‌توان میزان تولید کالوس را افزایش داد.
2. نوع و میزان عناصرغذایی محیط‌های مختلف کشت بر روی میزان کالوس‌زایی موثراست.
3. استفاده از متوقف‌کننده موادفنلی باعث افزایش کارایی تولید کالوس می‌شود.
4. استفاده ازهورمون‌های گیاهی کارآیی تولید مواد فنلی در کالوس را می‌توان افزایش داد.
5. با بکارگیری تکنیک‌های کشت‌بافت و بررسی جنبه‌های مختلف موضوع، می‌توان به پروتکلی جهت القای کالوس آلوئه‌ورا به منظور تکثیر انبوه و نیز دسترسی سریع به متابولیت‌های ثانویه دست یافت.

1-4 اهداف پژوهش
1. تعیین بهترین ترکیب هورمونی به همراه محیط کشت برای تکثیر سریع
2. تعیین بهترین ترکیب هورمونی برای القای کالوس
3. افزایش تولید مواد فنلی به کمک هورمون‌های مختلف

فصل دوم
مروری بر منابع

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

2-1 کلیات
2-1-1 تاریخچه گیاه آلوئه‌ورا
آلوئه‌ورا سابقه بسیار طولانی و درخشان دارد. اولین گزارش مکتوب که در آن به آلوئه‌ورا اشاره شده است متعلق به چهارهزار سال پیش از میلاد مسیح است و در غار نوشته‌ها و کنده‌کاری‌های روی ظروف در معابد باستانی مصر کشف شده است. در افسانه‌های به جای مانده از مصر باستان آمده است که آلوئه ورا گیاهی چنان گرامی بوده که افراد برای حضور در مراسم پس از مرگ یک فرعون باید تحفه‌ای از برگ‌های آن را تقدیم می‌کردند. براساس منابع قدیمی ارسطو رایزن الکساندرکبیر در سال 333 قبل از میلاد مسیح جزیره سوکوترا در اقیانوس هند را که به دلیل رویش آلوئه‌ورا در آن شهرت داشت، تصرف کرده است (فیروزآبادی، 1391).
گیاه آلوئه با دارا بودن سابقه مصرفی بیش از 4000 سال یکی از مهمترین گیاهانی است که در چند سال اخیر جایگاه ویژه‌ای در تحقیقات غذایی و دارویی داشته است. براساس اظهارنظر ( LASC)17 ارزش تجارت جهانی محصول خام این گونه گیاهی حدود 125 میلیون دلار و ارزش محصولات نهایی تولید شده آن بالغ بر 110 میلیارد دلار است (یزدانی وهمکاران، 1384).
اولین گزارش مبنی بر مصرف آلوئه به عنوان یک داروی مسهل در ایران، مربوط به الکیندی، فیلسوف و طبیب عرب 700 تا 800 سال پس از میلاد است (کمپرک و چیو18، 1999).
آلوئه‌ورا یک سابقه طولانی به عنوان لوسیون پوست دارد. مطالعات بیان می‌کند که زیبایی کلئوپاترا را به این گیاه نسبت داده‌اند (لی و کیم19، 2000).

2-1-2 گیاهشناسی
صبرزرد یا شاخ بزی با نام علمی Aloe barbadensis Mill Syn. A. Vera L. و نام‌های انگلیسی Medicine Aloe و Burn plant گیاهی گوشتدار از راسته لاله (لیلیاس)20، تیره لاله سانان (لیلیاسه)21 ، زیرتیره آلوئه (آلوئین)22 و جنس آلوئه است (قهرمان، 1373؛ بایلی23، 1963 و کوارتر و همکاران24، 1997).
آلوئه گیاهی گوشتی و چندساله با ساقه روزتی بوده و توان تولید پاجوش بر روی ریشه ضخیم خود را دارد. گیاه بالغ دارای 15-12 برگ ضخیم و گوشتی با کناره‌های خاردار است. برگ‌ها ضخیم و دارای پارانشیم بی‌رنگ موسیلاژدار و شیره چسبنده است که این قسمت به عنوان بافت ذخیره‌کننده آب در گیاه محسوب می‌شود (رضایی و همکاران، 1375).
برگ‌های سخت آبدار و نیزه‌ای این گیاه به طول 50 سانتیمتر رشد می‌کند و طول کل گیاه به بیش از 120 سانتیمتر می‌رسد. تنها برگ‌های این گیاه، ارزش دارویی دارند و در برخی از گونه‌های آن سرشار از رزین و ترکیبات سودمند می‌باشند. ژله شفاف و سفتی از قسمت‌های داخلی برگ ترشح می‌شود. بین این ژله و پوست بیرونی برگ سلول‌های خاصی حاوی مایع زردرنگ و تلخ قرار دارد. وقتی که این مایع خشک می شود، سبب تولید شیره آلوئه می‌شود (میرزایی ندوشن و همکاران، 1383؛ دیویس و همکاران25، 1987(.
برگ‌های آلوئه راست، شلوغ، پر از عصاره، سبز روشن، باریک و نوک تیز، بلند و صاف و دارای دندانه‌های خاردار در حاشیه، میله اصلی بلندتر از برگ‌ها ، فلس‌مانند و منشعب می‌باشند. گل‌های زرد به صورت گل‌آذین خوشه‌ای متراکم در انتهای میله‌ها قرار دارند (ونکاتارامالاه26، 2003).
ارتفاع آلوئه‌ورا حدود 60 سانتی‌متر بوده و ساقه این گیاه کم و بیش چوبی و ضخامت آن 5 تا 20 سانتی‌متر است. برگ‌ها نیزه‌ای شکل و مقعر است که مستقیما و بدون دمبرگ به ساقه متصل می‌باشند. در برخی گونه‌ها کنار برگ‌ها دارای خارهای مخروطی شکل کم و بیش خمیده به طول 2 میلی‌متر است. رنگ برگ‌ها سبز‌روشن است ولی در فصل سرما به رنگ قرمز متمایل شده و گاهی بر اثر شدت سرما خاکستری می‌شوند. سیستم ریشه‌ای این گیاه سطحی و ضعیف می‌باشد. تخمدان در این گیاه سه‌خانه‌ای و میوه به صورت پوشینه و از نوع کپسول و رنگ آن قهوه‌ای است ( فیروزآبادی، 1391).

شکل 2-2: گل‌آذین خوشه‌ای گیاه آلوئه‌ورا (ناتالی و همکاران، 1990)

گرده افشانی در این خانواده توسط حشرات و پرندگان صورت می‌گیرد که به واسطه نرعقیمی بالای موجود در این جنس، تولید‌‌‌‌مثل جنسی در آن راندمان پائینی دارد. گیاهان جنس آلوئه دارای عدد پایه کروموزمی 7 می‌باشند و امکان ایجاد سطوح بالای پلوئیدی در آن‌ها ممکن است با این حال بیشترین سطح پلوئیدی گزارش شده دیپلوئید است. در مطالعه‌ای که بر روی جمعیت‌های آلوئه بومی جنوب ایران صورت گرفته است، نشان داده شده که همگی دیپلوئید و دارای 14 کروموزوم می‌باشند (یزدانی و همکاران، 1384؛ میرزایی ندوشن و همکاران، 1383).
2-1-3 تکثیر
رایج ترین روش ریزازدیادی این گیاه، جداسازی اندام‌های مریستمی مثل نوک شاخساره یا جوانه‌های جانبی و تحریک آن‌ها به تولید گیاه کامل است (چادهوری و موکاندان27، 2001؛ هیریمبرگاما و گامیج28، 1995؛ میر و استادن29، 1991؛ ناتالی و همکاران، 1990).
ازدیاد در درجه اول از طریق شاخه‌های کناری یا خارجی انجام می‌شود که با دقت از گیاه بالغ جدا شده و منتقل می‌شود. این شاخه‌ها با اندازه متوسط انتخاب شده و باید با دقت از گیاه مادری جدا شود تا به گیاه پایه آسیبی وارد نشود (ونکاتارامالاه، 2003) .

2-1-4 گونه‌ها
جنس آلوئه شامل تقریبا 500 گونه می‌باشد. در میان آن‌ها تنها 5 گونه وجود دارد که عمدتا برای اهداف دارویی استفاده می‌شوند. این 5 گونه شامل: (پارک و لی30، 2006).
1. Aloe Vera
2. Aloe arborescens
3. Aloe perryi
4. Aloe ferox
5. Aloe saponaria

2-1-5 نیازهای اکولوژیکی
گیاه آلوئه به نور و گرما علاقه‌مند است. این گیاه اگر در حدود 2 ماه در معرض نور قرار بگیرد بدون حضور تنظیم‌کننده‌های‌رشد از بین نمی‌رود. در مقابل، از سرما، سایه و رطوبت گریزان است. وقتی که دمای محیط کمتر از 10- در جه باشد، سرمازده شده و نمی‌تواند رشد کند. اگر این گیاه برای مدت زمان طولانی در خاک دریاچه یا تالاب رشد کند، ریشه‌ها و برگ‌های آن به طور جدی صدمه دیده و به تدریج به نکروز تبدیل خواهند شد. جالب توجه است که آلوئه مقاومت قوی به خشکی، شوری و خاک‌های فقیر نشان می‌دهد و به همین دلیل می‌تواند در خاک‌های سست و بارور نسبت به خاک‌های مغذی که دچار کمبود هستند، رشد بهتری داشته باشند (ال وی و همکاران31، 2004).

2-1-6 خواستگاه و دامنه انتشار


پاسخ دهید